氏名　ZINIA RAHMAN
学位の種類　博士（工学）
学位記番号　博甲第492号
学位授与の日付　平成21年3月25日
学位論文題目　Evaluation and application of Trichoderma reesei cellulase and xylanase promoters　（Trichoderma reesei セルラーゼ・キシラナーゼプロモーターの評価および応用）
論文審査委員
　主査　教授　森川　康
　副査　准教授　岡田　宏文
　副査　教授　福田　雅夫
　副査　准教授　政井　英司
　副査　産学融合特任准教授　小笠原　渉

• 論文目次
• 論文要旨
• 論文審査の結果の要旨

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Contents
Chapter 1.　General introduction
　1.1　Introduction　p.1
　1.2　Cellulosic biomass　p.3
　1.3　Enzymatic degradation of cellulose and hemicellulose　p.5
　1.4　Domain structure and classification of cellulose and hemisellulose　p.7
　1.5　cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei　p.9
　1.6　Introduction of T. reesei cellulase and xylanase genes　p.12
　1.7　Cellobiose inhibition in T. reesei　p.16
　1.8　Improvement of T. reesei strains　p.17
　1.9　Expression of homologous and heterologous protein in T. reesei　p.19
　1.10　Aims of present study　p.23
Chapter　2.　Evaluation and characterization of Trichoderma reesei cellulase and xylanase promoters
　2.1　Introduction　p.24
　2.2　Materials and methods　p.26
　2.2.1　Strains and culture conditions　p.27
　2.2.2　Cloning of 5'-upstream and 3'-downstream regions flanking the cellulase genes　p.29
　2.2.3　Construction of GUS repoter plasmids for promoter abalysis　p.33
　2.2.3.1　Construction of cbh1-uidA expression cassette　p.37
　2.2.3.2　Construction of cbh2-uidA expression cassette　p.40
　2.2.3.3　Construction of egl1-uidA expression cassette　p.41
　2.2.4　Transformation, screening, determination of integration site and copy number　p.42
　2.2.5　Preparation of cell-free extracts and GUS activity assay　p.43
　2.2.6　RNA extraction, reverse transcription and quantitative realtime PCR　p.44
　2.2.7　cellulase activity and protein assay　p.49
　2.3　Results　p.51
　2.3.1　Assaying promoter strength using the GUS reporter　p.52
　2.3.2　Assaying promoter strength by measuring mRNA levels　p.55
　2.3.3　Enzymatic activities in the disruption mutants
　2.3.4　mRNA levels in the disruption mutants
　2.4　Discussion
Chapter 3.　Application of Trichoderma reesei cellulase and xylanase promoters through homologous recombination for enhanced production of extracellular s-glucosidase 1
　3.1　Introduction　p.60
　3.2　Materials and methods　p.62
　3.2.1　Microbial strains and culture conditions　p.62
　3.2.2　DNA minipulation and sequence analysis　p.63
　3.2.3　Construction of plasmids for bgl1 expression using egl3 and xyn3 promoters　p.68
　3.2.4　Transfomation and screening of transformants　p.69
　3.2.5　Isolation of RNA and analysis of the gene transcription　p.70
　3.2.6　cellulase activity and protein assay　p.70
　3.2.7　MALDI-TOF mass spectrometry　p.71
　3.2.8　Saccharification of cellulosic biomass　p.73
　3.3　Results　p.74
　3.3.1　Expression profile of egl3, xyn3 and bgl1 in T. reesei　p.77
　3.3.2　Construction of s-glucosidase overproducing strains　p.78
　3.3.3　Expression of mRNA and protein production in T. reesei E3B1 and X3B1　p.82
　3.3.4　Enzymatic activities of T. reesei strains PC-3-7, E3B1, and X3B1　p.86
　3.4　Discussion　p.89
Chapter 4.　Conclusion　p.98
Reference
List of publications

Comprehensive analyses on promoters of four cellulase and one xylanase genes of Trichoderma reesei were performed expressing a single reporter uidA from Escherichia coli to construct highly functional cellulase-overproducing strains. GUS amount expressed under the each promoter correlated entirely with each mRNA amount, suggesting that GUS production was controlled at the transcriptional level. The uidA transcript levels were much lower than the native gene mRNA’s but they were produced in proportion to the mRNA of native cellulase and xylanase genes driven by the same promoters except for the cbh2 promoter. Cellulose degrading activity and protein amount was reduced in cbh1 and cbh2 disruptant mutants compared to the wild type T. reesei PC-3-7 and other uidA transformants. The cbh1 disruptant strain was observed to produce more CBH II, EG I, EG III and xylanases than native PC-3-7 and the other uidA transformants with the same amounts of protein in SDS-PAGE gels. In the Pcbh1-gus, mRNA levels for cbh2 and egl1 genes were higher than those in native T. reesei PC-3-7 and all other disruptant strains. The cbh2 disruptant strain had the highest amount of cbh1 mRNA among the strains tested. Homologous integration of uidA at the egl1, egl3, and xyn3 loci was also found to cause a slight increased level of cbh1 mRNA, whereas mRNA levels for egl1, egl3 and xyn3 in all the disruptants were similar to those of T. reesei PC-3-7. One of the limiting factors for the application of Trichoderma reesei to degrade cellulosic biomass is its low β-glucosidase activity required to convert cellobiose to glucose. The egl3 and the xyn3 promoters were used to express β-glucosidase 1 gene bgl1, through homologous recombination to improve cellulose degradation ability of T. reesei. The recombinant strains expressing BGLI under the control of either the egl3 or the xyn3 promoter had 4.0 and 7.5 fold higher
β-glucosidase activity than the native strain, which compares well to the finding that in wild type T. reesei PC-3-7 the levels of egl3 and xyn3 mRNA expression were 6.0 and 12 fold higher, respectively, than that of bgl1. MALDI-TOF mass spectrometry analysis of proteins secreted by the recombinant strains demonstrated that BGLI was overproduced. The increase in the transcription of bgl1 and the concomitant elevated level of BGLI in these recombinant strains are sufficient to degrade cellobiose and cellotriose formed during degradation of pretreated cedar powder.

　本論文は、セルロース系バイオマスの効率的な酵素糖化に必須であるセルラーゼ高生産糸状菌Trichoderma reeseiの改変を目指して行われた一連の研究をまとめたものである。特に、T. reeseiにおける同種もしくは異種由来のタンパク質の発現系に着目し、そのために必須であるセルラーゼ・キシラナーゼ遺伝子のプロモーターの能力の解析およびその利用に焦点を絞ってまとめている。
　本論文は4章で構成され、以下の通りである。
　第1章は本研究の背景および現在まで得られているT. reeseiのセルラーゼ・キシラナーゼの生産性についての知見をまとめ、本研究を行う意義をまとめている。
　第2章では種々のセルラーゼ・キシラナーゼ遺伝子のプロモーターの遺伝子発現能力を解析している。cbh1、cbh2、egl1、egl3およびxyn3の5種のプロモーターを用いて大腸菌由来のβ-グルクロニダーゼ（GUS）をレポーターとして、T. reeseiにおいて発現させた株をそれぞれ構築している。それらの株のレポーター遺伝子の発現を定量的リアルタイムPCRおよびGUS活性からそれぞれmRNAレベルおよびタンパク質レベルで解析している。その結果からセルラーゼ・キシラナーゼ遺伝子のプロモーターに支配された遺伝子の発現量の比率は、転写および翻訳レベルで一致していることを明らかにしている。解析に用いた株は相同組換え体であるため、それぞれのセルラーゼ・キシラナーゼ遺伝子破壊株と見なせる。これらの株の解析から、egl3およびxyn3の破壊は全体のセルラーゼ活性に影響を及ぼさないことを明らかにし、この2つの遺伝子のプロモーターがT. reeseiのセルロース分解能力を向上させるために有用であることを示している。
　第3章ではセルラーゼ・キシラナーゼ遺伝子のプロモーターを用いて実際にセルラーゼ活性の向上を試みている。egl3およびxyn3のプロモーターを用いてT. reesei由来のβ-グルコシダーゼを発現させたところ、egl3プロモーターを用いた場合には4倍、xyn3プロモーターの場合には7.5倍まで活性を向上させることに成功している。さらに、これらの株の作るセルラーゼは植物バイオマスを効率的に糖化できることを示している。
　最後に第4章で総括を述べている。本論文で述べられた実験結果から、T. reeseiのセルラーゼ・キシラナーゼ遺伝子プロモーターのタンパク質発現能力について新たな知見が得られた。また、それらのプロモーターを用いてセルロース分解能力を改変させたT. reesei改変株を取得するための指針を示している。
　よって、本論文は博士（工学）の学位論文として十分な価値を有するものと認める。